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本制品是一种基于离心柱法从动物组织或培养的动物细胞中安全、快速、便捷、稳定、高效、高质量地提取miRNA等小于200个核苷酸的小RNA(small RNA)的试剂盒。

本试剂盒适用于新鲜或冻存的动物组织或细胞样品小RNA的提取。样品的用量对提取效果影响较大，样品用量过多会导致在第一次过柱时不能最大程度去除200nt以上的RNA，通常建议培养细胞的用量不超过100万，动物组织的用量不超过5mg。

本试剂盒用于提取18～200nt小RNA，主要包括5.8S rRNA、5S rRNA、tRNA、microRNA (miRNA)、及siRNA、piRNA、tsRNA等，能够有效去除基因组DNA和200nt以上的RNA，如28S rRNA、18S rRNA、mRNA等。

本试剂盒提取得到的小RNA可用于反转录、RT-PCR、qPCR、Northern等常规实验，也可以用于基因芯片分析(microarray)、高通量测序等对小RNA质量要求较高的情况。

• 本试剂盒使用安全。本试剂盒通过特殊的柱纯化介质进行小RNA分离纯化，不仅能有效避免传统的Trizol法提取时使用的酚、氯仿等有毒有害有机试剂，也能有效避免如国外知名的Q品牌等公司使用类似于Trizol的裂解液裂解样品、接着使用氯仿分层、后续再进行柱纯化等涉及的有毒有害有机试剂。
  
• 本试剂盒使用快速、便捷。本试剂盒采用柱纯化，无需繁琐的RNA沉淀步骤，提取操作过程仅20～25分钟。相比于传统的Trizol提取法，本试剂盒能够有效去除大分子RNA，操作流程显著简化，缩短了提取时间，降低了RNA降解的风险。和国外同类柱纯化产品相比，所需操作步骤和操作时间基本一致。
  
• 本试剂盒提取获得的小分子量RNA得率高、纯度好。100万培养动物细胞约能提取得到1～2μg小RNA，5mg小鼠肝脏组织约能提取得到1～1.5μg小RNA。A260/A280通常为2.0-2.2。

本试剂盒与国际知名T品牌同类产品的提取效果对比图参见图1。

图1．本试剂盒与T品牌同类产品的小RNA提取效果对比。样品为冻存的100万个HeLa细胞、5mg小鼠肝组织和5mg小鼠肾组织。洗脱液用量均为30μL。均取6μL洗脱的样品经变性处理后，在含7M尿素的15% TBE-PAGE中电泳约90分钟后在NadRed溶液中染色后拍照。百奥莱博试剂盒提取产物的A260/A280依次为2.01、2.07和2.06；T品牌试剂盒提取产物的A260/A280依次为1.93、1.79和1.29。实际提取效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，本图仅供参考。


本试剂盒提取小RNA的基本流程如图2所示。样品在裂解液中迅速裂解，释放出总RNA，然后在两次高速离心过程中，通过离心柱将不同大小的RNA分离。第一次过柱时，200nt以上的RNA特异性结合到纯化柱上，而200nt以下的小RNA穿柱而过被收集到液体收集管中；第二次过柱时，特定的结合体系使小RNA结合到另一个纯化柱上。然后通过2次洗涤充分去除非特异性结合的蛋白、盐等杂质，最后用洗脱液将高纯度的小RNA洗脱下来。

图2．离心柱式小RNA提取流程示意图。

组分	规格
裂解液	16mL
结合液I	16mL
结合液II	38mL
洗涤液	63mL
洗脱液	5mL
RNA纯化柱及废液收集管	100套
RNA洗脱管	50个

保存：室温，有效期1年。

• 对于富含RNase的样品(如动物组织)，建议使用前在裂解液中添加二硫苏糖醇(\DTT)至终浓度为40mM (例如1mL裂解液中加入20μL 2M DTT)或β-巯基乙醇至终浓度为1% (如1mL裂解液中加入10μL β-巯基乙醇)，含DTT或β-巯基乙醇的裂解液可在室温放置1个月。
  
• 本试剂盒提供的所有试剂和耗材都是RNase-free，操作时应小心，避免被污染。所有自行准备的试剂和耗材也都应是RNase-free。如果可能有RNase污染，可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后高温高压灭菌并烘干。操作时应避免对着样品或所使用的试剂盒耗材呼气或说话，以防RNase污染。建议戴一次性口罩操作。
  
• 对于操作环境中RNA酶的去除，推荐使用核酸酶喷雾清除剂(货号：YT400)以去除实验桌面上或其它接触面上的RNase。
  
• 使用冻存的细胞或组织提取小RNA的效果通常比新鲜的细胞或组织差一些。因为在细胞或组织冻融过程中一些细胞或组织内的RNase会被释放出来并剪切样品中的RNA。对于组织样品，推荐使用RNAstable动物组织RNA保存液(货号：YTB4010)进行保存以保证样品RNA的完整性。
  
• 本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。
  
• 废液收集管在一次提取中需多次使用，切勿中途丢弃。
  
• 结合液I、结合液II和洗涤液中含有乙醇，使用后须旋紧瓶盖以防挥发，并须按照易燃试剂的相关规范进行存放和使用。

• 实验材料的准备。
  
  • 细胞样品：收集50～100万左右的细胞。对于悬浮细胞，1000～2000g离心1分钟后弃上清，加入300μL裂解液，轻轻吹打8～10次至固悬物溶解、溶液澄清；对于贴壁细胞，吸净培养液后加入300μL裂解液，轻轻吹打5～10次至固悬物溶解、溶液澄清，转移至一洁净离心管内。
    
  • 组织样品：取5mg动物组织，置于液氮中研磨成粉末，立即加入300μL裂解液。也可将组织置于1.5mL离心管中，迅速加入300μL裂解液，用微型电动匀浆器匀浆，或者用普通玻璃匀浆器进行匀浆。研磨或匀浆后，轻轻吹打匀浆液8～10次，室温放置3～5分钟。然后约14000g离心2分钟，将上清液移至新的离心管中。对于比较容易裂解且匀浆很充分的组织(如肝组织、脑组织等)可以不用高速离心而直接进入步骤2。
  • 细胞的数量不超过100万，动物组织的用量不超过5mg，细胞或组织用量过多会导致大分子RNA不能去除完全。对于富含RNase的样品，裂解液中宜添加DTT至终浓度为40mM或添加β-巯基乙醇至终浓度为1%。
• 加入300μL结合液I至裂解液中，轻轻颠倒混匀3～5次。此时可能会有沉淀物产生，属于正常现象。
  
• 将混合物(包括沉淀物)转移至第1个纯化柱内，12000g离心30秒，回收收集管内液体至一新的1.5mL离心管。
  
  • 对于一些非常特殊的样品，如出现溶液未完全通过时，可延长离心时间至1～2分钟，或者加大离心力至16000g。对于一些能快速启动达到12000g的离心机，离心30秒已经足够，对于一些启动速度缓慢的离心机本步骤及后续步骤中的30秒离心宜调整为60秒。
• 向溶液中加入700μL结合液II，混匀后，将混合物(包括沉淀物)分两次转移至第2个纯化柱内，每次12000g离心30秒后倒弃收集管内液体。
  
  • 加入结合液II后溶液总体积超过纯化柱的容量(约750μL)，因此须分成2次过柱，即将一半的混合物(约650μL)加入纯化柱内后12000g离心30秒，倒弃收集管内液体，再将剩余的混合物加入纯化柱内12000g离心30秒，并倒弃收集管内液体。
• 加入600μL洗涤液，12000g离心30秒，倒弃收集管内液体。
  
• 重复步骤5一次。
  
• 最高速(约14000～16000g)离心2分钟，去除残留液体。
  
• 将RNA纯化柱置于一新的1.5mL离心管上，加入30～50μL洗脱液，室温放置2～3分钟，最高速离心30秒，所得溶液即为纯化的小RNA。
  
  • 洗脱液需要加到纯化柱柱面中央，使其被完全吸收。如需获得更高浓度的样品，可把洗脱液的体积减小至20μL，但洗脱下来的总RNA量会相对减少。室温较低时，洗脱液在37℃预热片刻对得率有所帮助。此外，洗脱后的溶液再次加回到原纯化柱再离心洗脱一次，可提高得率约10～30%；或者在第一次洗脱后使用新的洗脱液再洗脱一次，会获得约为第一次洗脱量10～35%的小RNA。

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